|
成果名称：蚯蚓抗菌肽研究
申请单位：中国农业大学
成果编号：鉴字[教NF2005] 第005号
鉴定日期：2005年5月19日
学 科：生态学
第一完成单位：中国农业大学
第一完成人：孙振钧
通讯地址和邮编：北京市海淀区圆明园西路 2号 中国农业大学资源与环境学院100094
电话：010－62732942 传真：010－62732149
成果内容摘要：
蚯蚓是以有机废物为食的腐生性动物，且食性很广，几乎所有的畜禽粪便经发酵后均可被蚯蚓食用，易于集约化高产养殖。蚯蚓生活于病原菌丛生的环境中，却极少患病，在缓慢的生物进化过程中，为适应不利的生存环境，其体内必然有独特抗菌与免疫系统，已经逐渐形成了防御微生物侵袭的有效机制。本课题首次在国内外提出并验证了两个假设：（1）肽类物质可能是蚯蚓体液抗菌系统的抗菌成分；（2）蚯蚓抗菌肽(蛋白)可以诱导获得并具有非专一性的免疫应答。
本研究运用热处理结合超滤法对蚯蚓（Eisenia foetida）体液抗菌物质进行了初步分离，再用阳离子交换分离和反相FPLC，得到蚯蚓抗菌肽。本课题建立的蚯蚓抗菌肽分离纯化方法，简便易行，收获率和纯度高，已经获得发明专利。本课题组1995年首次从蚯蚓(Eisenia foetida)体中证实蚯蚓抗菌肽的存在并分离出一种具有广谱抗菌作用的酸性四十肽后，由相继从蚯蚓的组织匀浆液、体腔液和体表粘液中分离纯化出另外6种抗菌肽，从而进一步证明了"肽类物质可能是蚯蚓体液抗菌系统的抗菌成分"这一假设。同时根据现有本实验室已经发现的几种抗菌寡肽的结构特点，首次提出了蚯蚓抗菌肽的一个家族-具有Ala-Met-Val-Ser-Gly 的5-7个氨基酸组成抗菌寡肽族，命名为：vermipeptides family。蚯蚓抗菌肽（EP1）具有抗菌谱广、抗菌活力强、理化性质比较稳定的特点。用不同pH溶液处理时，除pH1时抗菌物质失活外，pH为3, 5, 7, 9, 11时对抗菌活力影响很小；沸水浴处理，提取液中大部分蛋白质失活而沉淀下来，抗菌物质却损失很少，具有很好的热稳定性；
抗菌肽粗品ESP对大肠杆菌、绿脓杆菌和金黄色葡萄球菌的最低抑菌浓度分别为：6.25mg/mL，6.25mg/mL；12.5mg/mL。而ESP-1对大肠杆菌、绿脓杆菌和金黄色葡萄球菌的最低抑菌浓度分别为：6.25mg/mL，12.5mg/mL；50mg/mL。测定了抗菌肽EP2的肽序列为Ac-Ala-Met-Val-Ser-Ser，EP3的肽序列为Ac-Ala-Met-Val-Gly-Thr。最小抑菌浓度（MIC）实验表明，EP2与 EP3 对鹑鸡肠球菌 Enterococcus gallinarum、绿脓杆菌 Pseudomonas pyocyanea、鲍氏不动 Acinetobacter baumanii、土生克雷伯菌 Klebsiella terrigena 的MIC分别为11.4mg/L 和12.85mg/L，对粪肠球菌 Enterococcus faecalis 的MIC分别为 22.8mg/L和 25.68mg/L。对真菌白色念株菌 Candida albicans 没有表现为完全的抑制作用。抗菌肽EP4MGC803胃癌细胞有杀伤作用。ECP3可以诱导HeLa细胞凋亡, 其诱导凋亡作用与浓度有关。ECP3诱导HeLa细胞凋亡的阈值为0.75mg/mL，凋亡率为48.12%。同时发现抗菌肽能够抑制病毒DNA的复制。
采用单一因子分析与综合因子协调分析相结合的方法，结构与功能综合分析的方法，损伤刺激（切断）和无损伤刺激（震动和重金属处理）辨证分析的方法，阐明了外界生存环境变化。选出了蚯蚓抗菌物质的有效诱导方法-生物与电刺激法。首次提出了蚯蚓抗菌肽诱导表达的生态学机理-扳机原理。为进一步阐明蚯蚓对应激环境的生态适应性打下了基础。
蚯蚓抗菌肽发现不仅对揭示蚯蚓抗病机理具有重要意义。而且对开发新型有效、廉价的抗菌素，促进了农牧生态环境良性循环均具有重要意义。此外，如果能将该抗菌肽的基因转移到某些动植物种，获得高效表达，则可望培育出新的抗病品种。
| 
