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成果名称：重组人溶菌酶和牛乳铁蛋白N末端多肽基因表达及其活性研究
申请单位：中国农业大学
成果编号：鉴字[教PP2006] 第002号
鉴定日期：2006年4月14日
学 科：①550.1010 食品生物化学；②550.1010 食品生物化学
第一完成单位：中国农业大学
第一完成人：罗云波
通讯地址及邮编：北京海淀区清华东路17号303信箱，100083
电话、传真：01062736344
成果内容摘要：
1、通过RT-PCR反应，克隆了人溶菌酶的cDNA序列，经序列分析证明与已发表的序列完全一致。构建出重组表达质粒pPIC9K/hLZM和1 200株毕赤酵母重组表达菌株KM71/hLZM。通过G418筛选，共得到15株高拷贝毕赤酵母重组表达菌株KM71/hLZM。通过甲醇诱导表达，获得1株能高效分泌人溶菌酶的表达株Pp135，其最初表达产量为317mg/L，酶活性为32 035u/mL。通过培养基筛选试验，表明BGMY/BGMM、BGM/BMM、MGY/MMC等培养基均能诱导菌株表达人溶菌酶。为今后生产节约成本、便于人溶菌酶的纯化，本研究确定以培养基BGM/BMM培养和诱导菌株Pp135。通过研究确定诱导条件为：将100mL BGM培养物，以50mLBMM进行诱导表达，诱导温度为30℃，摇床设定为250rpm，诱导表达5天结束。其表达量为381mg/L。
2、选择鲁西黄牛肝脏提取gDNA, 根据已知的基因序列克隆了牛乳铁蛋白N末端多肽162 bp目的基因片段，经测序分析验证后成功地构建到表达载体中，得到重组表达质粒pGEX-4T1/rbLF-N和重组表菌株BL21/rbLF-N，通过IPTG诱导后成功表达，表达的融合蛋白占总的菌体蛋白的20.4%。对重组融合蛋白pGEX-4T1/rbLF-N 包含体通过复性和纯化，确定了复性最佳的复性条件为 pH 值为 8.5，蛋白溶液浓度为 100 μg/mL 和 DTT 浓度为 24 mmol/L；亲和层析后的目的蛋白纯度为93.23 %；对重组牛乳铁蛋白N末端多肽进行了陶瓷膜和发酵罐技术中试研究，多肽的产率达到2.2 g/L。用 0.4 % 的重组人溶菌酶和 1 % 的重组牛乳铁蛋白N末端多肽对生猪肉进行了抗菌保鲜试验。
3、该研究首次建立了牛乳铁蛋白 N 末端多肽（外显子2）在大肠杆菌中的重组表达体系，获得了高效表达牛乳铁蛋白 N 末端多肽菌株和高效分泌人溶菌酶的菌株。
4、首次对重组牛乳铁蛋白 N 末端多肽（外显子2）进行了复性和纯化研究，确定了最佳复性条件，纯化后的目的蛋白纯度达到 93.23 %。
5、首次用陶瓷膜和发酵罐技术对重组牛乳铁蛋白N末端多肽进行了中试研究。获得的重组牛乳铁蛋白N末端多肽的产率达到2.2 g/L。
6、首次用凝血酶和胃蛋白酶酶解重组牛乳铁蛋白 N 末端多肽并测定了酶解产物的抗菌活性，抗菌效果比报道的化学合成的牛乳铁蛋白肽高。用 0.4 % 的重组人溶菌酶和 1 % 的重组牛乳铁蛋白N末端多肽对生猪肉进行抗菌保鲜试验，效果显著。
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